免疫萃取的一般过程如图8-4所示．它包括四个基本步骤，即免疫亲和柱的平衡、目标化合物的免疫结合、非特异性吸附的冲洗、目标化合物的洗脱。

　　免疫萃取柱在准备用于样品的免疫萃取之前，首先要对之进行预平衡，又叫初始化。初始化的一般方法是依次用5倍柱体积的洗脱缓冲液和同样体积的吸附缓冲液冲洗免疫萃取柱。初始化的目的是除去残留在免疫萃取柱中的可能会对萃取结果造成干扰的化学试剂及其代谢产物。

　　初始化完成以后，将样品溶液的pH值调节为中性左右(pH5～8,因为免疫反应的最适pH值约为中性)，然后通过免疫萃取柱，溶液中的被分析物与抗体结合而被保留在柱中，其他物质大部分随溶液流出。为了解免疫亲和柱中抗体和被分析物结合的最佳酸度条件，需要事先用被分析物的标准溶液来选择萃取效率最高的最适pH值。此外，在样品的萃取过程中，还要尽量避免非特异性吸附的发生。通常，非特异性吸附是由于样品杂质的疏水性或与免疫吸附剂之间的离子作用造成的。因此，可以通过如下方法减少非特异性吸附的影响：

　　③使免疫吸附在半解离条件下进行，在此条件下，除抗体和抗原的特异性免疫反应外，其他化合物与抗体的结合应被抑制。

　　冲洗是在免疫萃取柱中加入样品之后，洗脱之前，用干净的溶液或缓冲液冲洗免疫萃取柱的过程。冲洗的作用一方面是清除免疫吸附剂的空体积；另一方面是除去与免疫吸附剂非特异性结合的基团。

　　目标化合物被免疫亲和柱选择性吸附以后，需要用洗脱溶液冲洗亲和柱，使目标化合物与抗体解离，然后被收集或直接在线进入HPLC等分离和检测系统，进行分析测定。洗脱条件的选择对免疫萃取方法的建立具有重要作用。对洗脱液的要求主要有三点：第一是要能有效地使目标化合物与抗体解离；第二是溶液用量要尽可能少；第二是对抗体活性的损害尽可能小。下面将对洗脱条件的选择进行详细介绍。

　　一般认为，目标化合物与抗体的免疫反应过程是这样的：首先目标化合物和抗体通过静电引力而相互吸引并以特定位置相互靠近；然后形成氢键，并将目标化合物和抗体间的水分子排出，抗原和抗体结合得更加紧密；最后，分子间通过范德华力形成稳定的非共价键，目标化合物被抗体吸附。要将目标化合物解吸下来，必须首先将抗原抗体复合物破坏。由于生化交互作用的能量非常高，因此必须显著地改变实验条件才能使抗原抗体复合物被破坏。目前，将日标化合物解吸的方法主要有两类：一类方法是竞争替换法，即用竞争性试剂如抗体、目标化合物的结构类似物等将目标化合物从抗体上夺取或替换下来；另一类方法是非竞争性方法，即显著提高抗原抗体复合物的解离常数，使目标化合物被解吸。这类方法主要有：使用离液剂，改变缓冲溶液的pH值，降低洗脱液极性，可逆性改变分子结构，升高溶液温度，电泳等。

　　竞争替换法需要用大量的抗体、替换试剂(抗原类似物或其他交叉反应试剂)冲洗免疫亲和柱，才能保证将目标化合物定量替换解吸下来，并且，替换试剂必须符合以下条件：①它必须与固定化抗体具有很强的交叉反应性；②在色谱柱上的保留时间必须与目标化合物有很大差异，否则，因为替换剂的用量非常大，它的峰可能会对目标化合物的峰造成干扰；③稳定性强，纯度高，因为低至0.01％～0.1％的杂质就会在色谱图上产生杂质峰；④价格低廉，毒性低，并且在实际样品中不存在。由于抗体较为昂贵，而符合条件的替换试剂又相对难以找到，所以这种方法只在临床研究中有所应用，在环境分析中则未见报道。

　　在溶液中，离液剂的作用是扰乱抗体周围的水环境，从而导致抗体二级结构和目标化合物与抗体之间的疏水作用的破裂，使目标化合物被解吸。离液剂已成功地用于免疫亲和柱上吸附的蛋白抗原的解吸[，所用的浓度一般在1.5～8mol·L-1。常见阴离子的离液作用强度由强到弱分别为：CC13COO-SCN-＞CF3COO-＞ClO4-＞I-＞NO3-＞Br-＞Cl-＞CH3COO-＞SO42-＞PO43-；常见阳离子的离液作用强度由弱到强分别为：NH4+＜Rb+＜K+＜Na+＜Cs+＜Li+＜Mg2+＜Ca2+＜Ba2+。

　　在免疫萃取中。降低洗脱液的pH值，使低分子量的目标化合物从免疫亲和柱上解吸下来．是常用的方法之一。在不改变离子强度的情况之下，洗脱液的pH值应与抗体蛋白的等电点相差3个pH值单位以上。可用于洗脱的缓冲体系有：甲酸(pH2.5)、丙酸(0.01～0.1mol·L-1)、甘氨酸-盐酸缓冲液(0.01～0.1mol·L-1；pH 1.5～3)、柠檬酸(0.1 mol·L-1)。通过降低洗脱液pH值使免疫复合物解吸可以减少对抗体可变区的损害，但是如果酸度过低也有可能使抗体发生形变：使用这种方法进行洗脱所带来的一个问题是洗脱液的用量比较大，在离线萃取时．洗脱完成后还需要一个相对比较困难的水溶液蒸发浓缩的过程。这会增加实验的劳动强度，并影响结果的重现性。在在线萃取中，这种缺陷可以通过在免疫亲和柱的后面加一个捕集柱(trapping column)的方式克服。图8-8是这一方法的示意图，第1步，将六通阀1和2置于“Load”位置，用吸附缓冲液(0.1 mol·L-1磷酸盐缓冲液，pH7.0)平衡免疫亲和柱，用色谱缓冲液(甲醇-水，80:20)平衡捕集柱和色谱分离柱；第2步，将六通阀1置于“Inject”位置，样品溶液通过免疫萃取柱，分析物与抗体结合；第3步是将六通阀1置于“Load位置六通阀2置于“Inject”位置，使洗脱缓冲液(0.05mol·L-1磷酸盐缓冲液，pH 2.5)通过免疫萃取柱将分析物洗脱并送入捕集柱，使分析物被吸附；最后一步是将六通阀2置于“Load位置，色谱缓冲液通过捕集柱使分析物解吸附．并在分离柱上被分离。通过改变缓冲液pH值将分析物洗脱的方法有两个优点：第一，免疫亲和柱可以做得比较大，并且样品的加入速度可以比较高；第二，由于流过免疫亲和柱的溶液全部为水溶液，所以有利于减少洗脱过程对固定化抗体的损害，延长免疫亲和柱的使用寿命。

　　另外一个常用的洗脱方法是利用水一有机溶剂混合体系对目标化合物进行解吸。有时，在使用有机溶剂的同时还采用降低pH值或者pH值梯度洗脱的方法以提高洗脱的效率。有机溶剂洗脱的原理是溶液中的有机溶剂可以破坏抗原抗体复合物的疏水性结合部分，使抗原解吸。这种方法的优点是：①洗脱液用量少，洗脱时间短；②洗脱液可以作为HPLC等分离仪器的流动相，直接进入色谱柱进行检测；③洗脱液中有机溶剂含量越高，则蒸发浓缩越方便，一可用干目标化合物的离线萃取。实际上，在许多离线萃取过程中，包括一些已经商品化的免疫萃取柱中所使用的洗脱溶液就是较高比例的有机溶剂和水的混合溶液，甚至是纯的有机溶剂，比如乙腈甲醇等。但是，由干纯有机溶剂作为洗脱剂对目标化合物的解吸是以破坏抗体的二级结构为代价的，所以免疫亲和柱只能一次性使用。如果希望多次使用免疫亲和柱，则应采用有机物一水溶液混合体系，并尽量减少有机溶剂的使用量。

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