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　　1、有机溶剂萃取讲义萃取是生物分离中常用的单元操作原料前处理生物反应工程生物分离工程产品固液分离分离提取纯化精制利用在两个互不相溶的液相中各种组分（包括目的产物）溶解度的不同，从而达到分离的目的相似相溶的原理，选择与目的物结构相近的溶剂 何谓萃取分子结构相似:组成,官能团根据萃取目标物的介电常数寻找极性相近的溶剂为萃取溶剂.一个良好的溶剂要满足以下几方面要求:有大的萃取容量:即单位体积的萃取溶剂能萃取大量的产物有良好选择性:理想情况只萃取产物而不萃取杂质与被萃取的液相(通常是水相)互溶度小,且粘度低,;界面张力不或适中,有利于相的分散和两相分离.溶剂的回收和再容易化学稳定性好,不易分解,对设备腐蚀

　　2、性小经济性好,价廉易得安全性好,无毒性或毒性低.不同的萃取剂对溶质的萃取效果不同。如疏水性的青霉素G和V酸性很强，其pKa值为2.53.1，相对分子质量分别为334和350，适宜用有机溶剂从发酵液中萃取，在pH 2.53.0范围内，用乙酸戊酯和乙酸丁酯作为萃取剂的萃取效率高（如下表）。 青霉素在不同萃取剂中的分配系数溶剂pH 2.5（溶剂/水）pH 7.0（溶剂/水）乙酸戊酯45/11/235乙酸丁酯47/11/186乙酸乙酯39/11/260氯仿39/11/22012/11/190物理萃取即溶质根据相似相溶的原理在两相间达到分配平衡，萃取剂与溶质之间不发生化学反应。例如，利用乙酸丁酯萃取

　　3、发酵液中的青霉素即属于物理萃取。化学萃取则利用脂溶性萃取剂与溶质之间的化学反应生成脂溶性复合分子实现溶质向有机相的分配。萃取剂与溶质之间的化学反应包括离子交换和络合反应等。物理萃取和化学萃取化学萃取中通常用煤油、己烷、四氯化碳和苯等有机溶剂溶解萃取剂，改善萃取相的物理件质，此时的有机溶剂称为稀释剂(diluent)。由于氨基酸和一些极性较大的抗生素的水溶性很强，在有机相中的分配系数很小甚至为零，利用一般的物理萃取效率很低，需采用化学萃取。可用于抗生素的化学萃取剂有长链脂肪酸(如月桂酸)、烃基磺酸、三氯乙酸、四丁胺和正十二烷胺等。它们与抗生素形成复合物分子的疏水性比抗生素分子本身高得多，从而在有

　　4、机相中有很高的溶解度。萃取和反萃取在溶剂萃取分离过程中，当完成萃取操作后，为进一步纯化目标产物或便于下一步分离操作的实施，往往需要将目标产物转移到水相。这种调节水相条件，将目标产物从有机相转入水相的萃取操作称为反萃取(Back extraction)。除溶剂萃取外，其他萃取过程一般也要涉及反萃取操作。对于一个完整的萃取过程，常常在萃取和反萃操作之间增加洗涤操作，如下图所示，洗涤操作的目的是除去与目标产物同时萃取到有机相的杂质，提高反萃液中目标产物的纯度。下图中虚线表示洗涤段出口溶液中含有少量目标产物，为提高收率，需将此溶液返回到萃取段。经过萃取、洗涤和反萃取操作，大部分目标产物进入到反萃相(第

　　5、二水相)，而大部分杂质则残留在萃取后的料液相(称作萃余相)。萃取、洗涤和反萃操作过程示意图萃取体系的构成料液:供提取的溶液,通常水溶液溶质:从料液中提取出来的物质萃取剂:用来萃取产物的溶剂萃取液:溶质转移到萃取剂中形成的溶液萃余液:被萃取出溶质后的料液称为.杂质溶质料液（原）萃取剂Light phase萃取相Heavy phase、萃余相在一定温度和压力下，溶质分配在两个不相溶的溶剂中达到平衡后，溶质在这两相的浓度比为一常数K，此常数称为分配系数是衡量萃取体系是否合理的重要参数：y-平衡时溶质在萃取相中的浓度X-平衡时溶质在萃余相中的浓度分配系数操作过程中，分配系数K越大，提取效率也越大，萃取

　　6、就越容易进行完全。当K值较小时，可以采取分次加入溶剂、连续对此提取来提高萃取率。产物的萃取效率与萃取溶剂和水相的性质有关.水相条件对萃取的影响 1）PH 影响选择性.如青霉素在PH2萃取,萃取液中(醋酸_酯)青霉烯酸可达青霉素_量度2.5%,在PH3中则下降到4%,PH选择在使产物稳定的范围内.2）温度:影响稳定性,一般在低温下进行,影响分配子数3）盐析:降低产物在水中的溶解度.如提Vb12时加硫铵，促进Vb12从水转入有机相中；提青霉素进加NaCl.促进青霉素从水转入有机相中4）带溶剂:它们能与产物形成复合物,使产物易溶于有机溶剂中.复合物在一定条件下又要易分解.如青霉素可用脂肪碱作带溶剂.

　　7、（化学萃取）萃取操作(1)混合:料液与萃取剂充分混合形成具有很大比表面积的乳浊液.产物自料液转入萃取剂中.(2)分离:分离或萃取相和萃余相(3)溶剂回收:从萃取相中分离出有机溶剂.所需设备：混合器（如搅拌混合器）、分离器（如碟片式离心机）、溶剂回收装置（如蒸馏塔）混合萃取和分离也可在同一台设备中，如Alfa-Laval萃取机。单级萃取： 料液与萃取剂加入混合物中搅拌平衡后的溶液送到分离器内分离得萃取相L萃余相R,L送到回收器.多级萃取：是工业生产最常用的萃取流程 分离效率高 产品回收率高 溶剂用量少 萃取流程使含溶质的溶液（h）和萃取剂（L）混合，静止后分成两层。单级萃取多级错流萃取：将多个混

　　8、合澄清器单元串联起来，各个混合器中分别通入新鲜萃取剂，而料液从第一级通入，逐次进入下一级混合器的萃取操作称为多级错流接触萃取， 每次加新溶剂, 目标物浓度低, 萃取完全 多级逆流萃取将多个混合澄清器单元串联起来，分别在左右两端的混合器中连续通入料液和萃取液，使料液和萃取液逆流接触，即构成多级逆流接触萃取。反向进入，目标物在萃取液中浓度高，耗量少三级错流萃取装置a艾德连式三级错流萃取装置b泵混合分离器三级错流萃取装置c加挡齐格勒接触器三级错流萃取装置d霍米莫脱接触器乳化和去乳化实际发酵产物的萃取操作中常发生乳化现象。乳化即水或有机溶剂以微小液滴形式分散于有机相或水相中的现象。产生乳化后使有机相和

　　9、水相分层困难，出现两种夹带：发酵废液(萃余液)中夹带有机溶剂(萃取液)微滴，使目标产物受到损失；有机溶剂(萃取相)中夹带发酵液(萃余液)，给后处理操作带来闲难。 油水是互不相容的，要形成稳定的乳浊液，一般要有第三种物质表面活性剂的存在。表面活性剂指一端具亲水基团,一端具有亲油基团,发酵液中PR（O/W）是主要的表面活性剂.如果当表面活性剂的亲水基团强度大于亲油基团易生成水包油型,反之形成油包水型.产生乳化的主要原因是发酵液中存在的蛋白质相固体颗粒等物质，这些物质具有表面活性剂的作用，使有机溶剂(油)和水的表面张力降低，油或水易于以微小液滴的形式分散于水相或油相中。产生乳化后，需采取某种手段破坏

　　10、乳浊液，提高萃取操作收率。破乳方法在实施萃取操作前，对发酵液进行过滤或絮凝沉淀处理，可除去大部分蛋白质及固体微搅，防止乳化现象的发生。破乳方法:过滤,离心,加入电解质,物理法(加热,稀释释,吸附)、顶替法(戊醇)、转型法防止乳化:除去Pr.双水相萃取Two-aqueous phase extraction 基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的变化给固-液分离带来了困难，同时这类产品的活性和功能对pH值、温度和离子强度等环境因素特别敏感。由于它们在有机溶剂中的溶解度低并且会变性，因此传统的溶剂萃取法并不适合。采用在有机相中添加表面活性剂产生反胶束的

　　11、办法可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。因此基因工程产品的商业化迫切需要开发适合大规模生产的、经济简便的、快速高效的分离纯化技术。其中双水相萃取技术(two-aqueous phase extraction,ATPS)，又称水溶液两相分配技术(Partion of two aqueous phase extraction)是近年来出现的引人注目、极有前途的新型分离技术。 双水相萃取法的特点是能够保留产物的活性，整个操作可以连续化，在除去细胞或细胞碎片时，还可以纯化蛋白质25倍，与传统的过滤法和离心法去除细胞碎片相比，无论在收率上还是成本上都要优越得多。除此以外，处理量相同时，双水相萃取法比

　　12、传统的分离方法,设备需用量要少310倍，因此已被广泛地应用在生物化学、细胞生物学和生物化工领域，进行生物转化、蛋白质、核酸和病毒等产品的分离纯化和分析等。用此法来提纯的酶已达数十种，其分离过程也达到相当规模，如乙醇脱氢酶的分离已达到几十千克湿细胞规模，-半乳糖苷酶的提取也到了中试规模等。双水相萃取法和传统的分离方法(如盐析或有机溶剂沉淀等)相比也有很大的优势，如以-半乳糖苷酶为例，用沉淀或双水相萃取纯化的比较见下表。双水相系统：某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两相系统。利用物质在不相溶的，两水相间分配系数的差异进行萃取的方法应用：蛋白质特别是胞内蛋白质的分离纯化。一、双水相系

　　13、统形成原因：聚合物的不相容性，即聚合物分子的空间阻碍作用，无法形成均一相，具有相分离倾向，一定条件下分成两相。常用于分离的双水相系统：双聚合物：聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dex)。该系统上相富含PEG，下相富含Dex；聚合物与无机盐：聚乙二醇(PEG)/磷酸钾（KPi)。该系统上相富含PEG，下相富含KPi。双水相萃取的原理依据悬浮粒子与其周围物质具有的复杂的相互作用：氢键电荷力疏水作用范德华力构象效应a两相区双节线均相区两相区临界点双水相系统的相图（双节线）系线：连接双节线上两点的直线。同一系线上各点：两相组成相同，体积不同。系线(TMB)长度：衡量两相间相对差别的尺度。越长则两相间性质差

　　14、别越大，反之则越小；趋向于零时，（双节线上的点，临界点），两相差别消失，成为均一相。 在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而体积不同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则，即二、双水相中的分配平衡 与溶剂萃取相同，溶质在双水相中的分配系数也用m=c2/c1表示。为简便起见，用c1 和c2分别表示平衡状态下下相和上相中溶质的总浓度。 有关双水相系统中溶质分配平衡的理论已有很多研究报导。但是，由于影响双水相系统中溶质分配平衡的因素非常复杂，很难建立完整的热力学理论体系。从双水相萃取过程设计的角度出发，确定影响分配系数的主要因素是非常重要的。已有的大量研究表明，生物分子的分配系数取决于溶质与

　　15、双水相系统间的各种相互作用，其中主要有静电作用、疏水作用和生物亲和作用等。因此，分配系数是各种相互作用的和.lnm=lnme+lnmh+lnmlme，mh，ml 分别为静电作用、疏水作用和生物亲和作用对溶质分配系数的贡献。成相高聚物浓度界面张力成相高聚物的相对分子量一般来说，蛋白质等高分子量物质易集中于低分子量相盐类(包括离子的类型和浓度、离子强度、pH值)，溶质的物理化学性质(包括分子量、等电点)以及体系的温度等。影响物质分配平衡的因素三、影响萃取效果的因素1.成相聚合物分子量：降低聚合物的分子量，则蛋白质容易分配于富含该聚合物的相中。总浓度：越大则两相性质的差别越大，系线越长，蛋白质越容易

　　16、分配于其中的某一相。盐的种类和浓度对分配系数的影响主要反映在对相间电位和蛋白质疏水性的影响。在双聚合物系统中，无机离子具有各自的分配系数，不同电解质的正负离子的分配系数个同，当双水相系统中含有这些电解质时，由于两相均应各自保持电中性，从而产生不同的相间电位，因此，盐的种类(离子组成)影响蛋白质、核酸等生物大分子的分配系数，盐浓度不仅影响蛋白质的表面疏水性，而且扰乱双水相系统，改变各相中成相物质的组成和相体积比。2.盐和缓冲液的影响例如，PEG/KPi系统中上、下相(或称轻重相)的PEG和磷酸钾浓度以及Cl离子在上、下相中的分配平衡随添加NaCl浓度的增大而改变。这种相组成即相性质的改变直接影响

　　17、蛋白质的分配系数。离子强度对不同蛋白质的影响程度不同，利用这一特点，通过调节双水相系统中的盐浓度，可有效地萃取分离不同的蛋白质。3.pH值影响蛋白质的表面电荷数Z：影响蛋白质的解离度。影响：影响磷酸盐的解离。4.温度主要影响双水相系统的相图。大规模双水相萃取操作一般在室温下进行，主要基于以下考虑：PEG对蛋白质有稳定作用；溶液粘度较低，容易相分离；节省冷却费用。双水相萃取的优点较多用于胞内酶的提取和精制平衡时间短、含水量高、截面张力小，特别适合于生物活性物质的分离纯化操作简便易于放大要成功运用双水相萃取应满足的条件：欲提取的酶和细胞碎片应分配在不同的相中；酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积

　　18、比时，经过一次萃取，就能得到较高的收率；两相用离心机很容易分离。四、双水相萃取操作1.萃取和平衡1）双水相系统的选择：根据目标蛋白质和杂质的疏水性、分子量、等电点和表面电荷等性质上的差别，综合利用静电作用、疏水作用和添加适当种类和浓度的盐，可选择性萃取目标产物。设计试差实验，确定最佳萃取系统：常利用多组10mL刻度离心管进行分配平衡实验。配制高浓度的聚合物和盐的备用溶液，利用其配制一系列不同浓度、pH和离子强度的双水相；加入料液后，再加水稀释，然后充分混合；离心使两相完全分离；分别测定上、下相中目标产物浓度或生物活性，计算分配系数。2）胞内蛋白质的萃取优势：可选择性地使细胞碎片分配于下相，目标

　　19、产物分配于上相，同时实现目标产物的部分纯化和细胞碎片的除去。细胞匀浆液浓度选择：为降低成本，应尽量高，但过高会扰乱系统，降低分配系数，系统粘度增高，相分离困难。一般上限为200400g湿细胞/Kg萃取系统。2.上下相的分离利用重力和离心力离心沉降可大大加快相分离速度，并易于连续化操作。对含细胞碎片的萃取系统，少于40秒。3.多聚物的分离除去产物所在相中的多聚物得到纯净物产物若分布在PEG富集的相中，相与相分离后，上相中加入盐，形成新的双水相体系，在适当条件下，蛋白质被重新萃取 进入盐相， PEG得到回收，盐中少量残余的PEG可用超滤或透析法除去。五、应用多步萃取细胞匀浆液中目标产物可经过多步萃取获得较高的纯化倍数。大规模双水相萃取由于相混合能耗低，相平衡时间短，故双水相萃取规模放大非常容易，10mL刻度离心管的实验结果可准确放大到处理200Kg细胞匀浆液规模。

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