本发明涉及一种从脂肪、油或由其得到的脂肪酸经过化学改性而获得脂肪、油或脂肪酸的方法。更具体地说，本发明涉及从粗鱼油中提纯高含量DHA、EPA的方法。

　　很早以前人们就发现心脑血管患者，血红细胞中的C20-C22的不饱脂肪酸(Polyunsaturated fattiy acids PUFAS)含量显著低于正常人，给病人补充C20-C22PUFAS，几天后患者膜脂组成发生显著变化，PUFAS显著增加，血脂随之下降，到60年代中期Gunning等进一步肯定了膳食中的PUFAS比率与血清总胆固醇下降成极显著的回归关系(r＝0.9)，直到1978 Dyerberg等首次报道格陵兰爱斯基摩人的心血管发病率低与食鱼有关以来，鱼油中廿碳五烯酸(eicosapentaenoicacid)EPPA、廿二碳六烯酸(docosahexentaenoic acid)DHA才真正引起人们的重视，大量的研究证实，EPA、DHA具有降血脂、抗血小板聚集，缓和血栓形成、保护脑血管等作用，尤其是DHA还可以增加大脑功能，提高判别力，增强记忆力和注意力。在大脑和视网膜上DHA还可通过膜联蛋白的活性对神经细胞和视网膜光感受中的结构和功能发生作用，这有助于胎儿，婴幼儿大脑锥体细胞和视网膜杆细胞生长、发育、孕妇服用DHA有助于胎儿脑细胞发育，特别是早产儿服用DHA以维护其视杆细胞的正常发育，保证不致产生由于缺少DHA所造成的视力减弱的遗憾。由于人体自身不能合成DHA，所以研制高纯度DHA产品意义是非常重大的。由于EPA和DHA的功效显著，含DHA、EPA的产品大量上市，但现售产品由于含量不高，杂质较多，服用后会引过氧化物中毒、腹泻、消化不良，儿童服用会引起性早熟，服用剂量大等副作用，尤其不利于婴幼儿服用。

　　为了提高EPA、DHA纯度，国内外学者和生产厂家进行了广泛地研究。现在主要的分离方法有脂肪酶法、尿素包合法、低温结晶法、金属盐沉淀法、超临界萃取法、减压分馏法、分子蒸馏法、硝酸银溶液萃取法及综合法等。

　　公开日

　　<263145)。杨琦等人报道了用综合法提取鱿鱼鱼油中的多烯脂肪酸，即采用盐析法、低温冷冻法、尿素包合法等方法的综合应用，EPA和DHA总含量可达到70％以上(杨琦，杨官娥等(山西医科大学生物化学教研室)。综合法提取鱼油中多烯脂肪酸的研究。中国海洋药物，2001，20(5)21-23)。陶海荣等人报道了以鱼油为原料，经低温结晶、减压蒸馏及薄层色谱法逐步提纯，分别获得了含量高于99％的(甲酯)EPA和DHA(甲酯)(陶海荣，李和(北京师范大学化学系)。从鱼油中分离高纯度的EPA和DHA。中国海洋药物，2000，19(5)24-26)。

　　但是，以上现有技术中的方法或因成本较高或因操作复杂都不能轻易得到高纯度的DPA、DHA产品。例如，减压分馏法分离效果不够理想，产品易过热氧化；分子蒸馏设备的成本较高，一般进行鱼油精制分离校每小时20-30kg计算，费用约在130万元；超临界萃取法设备的费用更大；尿素包合法对实验条件限制较严，操作繁琐，一般在低温条件下(-30℃)，硝酸盐溶液萃取法不易进行大量生产。

　　本发明者经过对粗鱼油分离提纯高含量DHA、EPA进行大量研究，在国内外首先研究出以硝酸银水溶剂法分离提纯EPA、DHA的方法。

　　本发明的方法主要通过以下步骤完成先将粗鱼油乙酯化，再通过Ag+与不饱和双键形成络合物的特性使鱼油中含不饱和双键的DHA、EPA与Ag+反应生成络合物，并将DHA、EPA的混合物分离出来，然后通过Ag+(EPA)络合物、Ag+(DHA)络合物的稳定性不同，分离出高含量的DHA和EPA含量高于DHA的产品。

　　在本发明的方法中，原料粗鱼油是国产的粗鱼油，并且可以选自沙丁鱼油、金枪鱼油、鲣鱼油、黄鲫油或鳀鱼油的粗鱼油。

　　在本发明的方法中，可以按以下步骤完成粗鱼油的酯化将粗鱼油、无水乙醇、浓H2SO4加入反应体系，水浴回流进行反应，然后放入分液漏斗，静置过夜，分出酯化层，并回收乙醇。其中以1000克粗鱼油计算，加入无水乙醇800-2000ml，浓H2SO48-20克，反应时间为10小时，得到鱼油酯化产品900-1125克。

　　在本发明的方法中，可以按以下步骤完成Ag+(EPA)络合物、Ag+(DHA)络合物的制备将乙酯化鱼油产品、AgNO3水溶液加入反应体系，室温反应3小时，放入分液漏斗，分离油层，得Ag+(EPA)络合物和Ag+(DHA)络合物产品，回收未反应的乙酯化鱼油。其中AgNO3水溶液的浓度为50-80％，并且以1000克乙酯化鱼油计算，加入500-1000克AgNO3水溶液。

　　在本发明的方法中，可以按以下步骤完成EPA、DHA混合物的制备室温条件下，往Ag+(EPA)络合物和Ag+(DHA)络合物中加入10-20倍体积的水，用正己烷萃取3次，有机层用无水硫酸钠干燥，回收溶剂得到DHA-EPA的混合物。

　　在本发明的方法中，可以按以下步骤完成高含量EPA的分离制备室温条件下，将Ag+(EPA)络合物和Ag+(DHA)络合物用2-5倍体积水溶解，用正己烷萃取3次，有机层用无水Na2SO4干燥，回收溶剂。其中所得产品中EPA的含量为49％，DHA的含量为23.6％。

　　在本发明的方法中，可以按以下步骤完成高含量DHA产品的制备室温条件下，将Ag+(EPA)络合物和Ag+(DHA)络合物用水稀释2-5倍，分离有机层，水层用水稀释20倍，再用正己烷萃取3次。其中所得产品中EPA的含量为3.76％，DHA的含量为95.56％。

　　在本发明的方法中，可以用正己烷或石油醚萃取提纯后的Ag+残留溶液，分离出有机物，水层在水浴上浓缩至液面起膜放凉得结晶，过滤，得AgNO3固体，回收的AgNO3固体可继续用于粗鱼油的分离提纯。其中石油醚回收可重复使用。

　　本发明的方法不仅适应于实验室分离粗鱼油产品，也可进行大规模的分离生产。使用本发明的方法提纯EPA、DHA不需要特殊设备的投资，工艺简单，成本较低，产品纯度高，而且所有使用的试剂材料都可回收，此方法分离率根据粗油含量不同有所不同，根据粗鱼油总重量计算一般达20％，EPA、DHA总含量90-100％。高含量的DAH、EPA产品可以消除现售鱼油产品因杂质所造成的副作用，使现售产品更新换代，这对提高人民健康水平意义是非常重大的。

　　实施例11.材料与仪器、理化指标及检测方法1.1材料与试剂 粗鱼油(舟山渔业公司提供)无水乙醇(AR天津市试剂二厂)硝酸银(AR天津市试剂一厂)浓硫酸(AR天津市试剂二厂)正己烷(AR北京化工厂)1.2.实验仪器分液漏斗电动搅拌器磁力搅拌器圆底瓶三角瓶旋转薄膜蒸发仪水循环泵线.产品测定方法 DHA、EPA含量测定气相色谱法2.实验部分 以国产粗鱼油为原料，先乙酯化，再通过Ag+与不饱和双键形成络合物的特性使鱼油中含不饱和双键的DHA、EPA与Ag+反应生成络合物，并将DHA、EPA的混合物分离出来，然后通过Ag+(EPA)络合物、Ag+(DHA)络合物的稳定性不同，分离出高含量的DHA和EPA含量高于DHA的产品。

　　2.1粗鱼油的酯化将粗鱼油1000g、无水乙醇800ml、浓H2SO48g加入反应体系，水浴回流，反应10小时，然后放入分液漏斗，静置过夜，分出酯化层，得鱼油酯化产品900g，其中含DHA 30.07％，EPA 10.11％。乙醇回收。

　　2.2 Ag+(EPA)络合物、Ag+(DHA)络合物的制备将乙酯化鱼油产品40g、70％AgNO3水溶液40g加入反应体系，室温反应3小时，放入分液漏斗，分离油层，得Ag+(EPA)络合物和Ag+(DHA)络合物产品，回收未反应的乙酯化鱼油。

　　2.3 EPA、DHA混合物的制备室温条件下，将上步所得Ag+(EPA)络合物和Ag+(DHA)络合物中加入20倍体积的水，用正己烷50ml×3萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，回收溶剂得到DHA-EPA的混合物16g。产率20％。EPA 25.38％，DHA 69.31％，总含量94.69％。

　　2.4高含量EPA的分离制备室温条件下，将自制的Ag+(EPA)络合物和Ag+(DHA)络合物用5倍体积水溶解，用正己烷20ml×3萃取，有机层用无水Na2SO4干燥，回收溶剂，得EPA(49％)DHA(23.6％)产品6g，总含量72.6％。

　　2.5高含量DHA产品的制备室温条件下，将Ag+(EPA)络合物和Ag+(DHA)络合物用水稀释5倍，分离有机层，水层用水稀释20倍，再用正己烷50ml×3萃取。DHA(95.56％)EPA(3.76％)产品10克，总含量99.32％。

　　2.6 Ag+盐回收实验将含Ag+残留溶液300g用石油醚萃取分离出有机物，(石油醚回收可重复使用)水层在水浴上浓缩至液面起膜放凉得结晶，过滤，得AgNO3固体，AgNO3的回收率＞98％。回收的AgNO3固体可继续用于粗鱼油的分离提纯。

　　实施例21.材料与仪器、理化指标及检测方法1.1材料与试剂 粗鱼油(舟山渔业公司提供)无水乙醇(AR天津市试剂二厂)硝酸银(AR天津市试剂一厂)浓硫酸(AR天津市试剂二厂)正己烷(AR北京化工厂)1.2.实验仪器分液漏斗电动搅拌器磁力搅拌器圆底瓶三角瓶旋转薄膜蒸发仪水循环泵线.产品测定方法 DHA、EPA含量测定气相色谱法2.实验部分 以国产粗鱼油为原料，先乙酯化，再通过Ag+与不饱和双键形成络合物的特性使鱼油中含不饱和双键的DHA、EPA与Ag+反应生成络合物，并将DHA、EPA的混合物分离出来，然后通过Ag+(EPA)络合物、Ag+(DHA)络合物的稳定性不同，分离出高含量的DHA和EPA含量高于DHA的产品。

　　2.1粗鱼油的酯化将粗鱼油200g、无水乙醇400ml、浓H2SO44g加入反应体系，水浴回流，反应10小时，用50ml×5水洗，得鱼油酯化产品225g，其中含DHA 30.07％，EPA 10.11％。

　　2.2 Ag+(EPA)络合物、Ag+(DHA)络合物的制备将乙酯化鱼油产品80g、70％AgNO3水溶液40g加入反应体系，室温反应3小时，放入分液漏斗，分离油层，得Ag+(EPA)络合物和Ag+(DHA)络合物产品，回收未反应的乙酯化鱼油。

　　2.3 EPA、DHA混合物的制备室温条件下，将上步所得Ag+(EPA)络合物和Ag+(DHA)络合物中加入10倍体积的水，用正己烷50ml×3萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，回收溶剂得到DHA-EPA的混合物16g。产率20％。EPA 35.21％，DHA 58.22％。

　　2.4高含量EPA的分离制备室温条件下，将自制的Ag+(EPA)络合物和Ag+(DHA)络合物用2倍体积水溶解，用正己烷20ml×3萃取，有机层用无水Na2SO4干燥，回收溶剂，得EPA(49％)DHA(23.6％)产品5g。

　　2.5高含量DHA产品的制备室温条件下，将Ag+(EPA)络合物和Ag+(DHA)络合物用水稀释2倍，分离有机层，水层用水稀释20倍，再用正己烷50ml×3萃取。DHA(95.56％)EPA(3.76％)产品10克。

　　2.6 Ag+盐回收实验将含Ag+残留溶液200g用正己烷萃取分离出有机物，(正己烷回收可重复使用)水层在水浴上浓缩至液面起膜放凉得结晶，过滤，得AgNO3固体，AgNO3的回收率＞98％。回收的AgNO3固体可继续用于粗鱼油的分离提纯。

　　3.成本合算我们以提纯EPA、DHA总含量90％与市售30％EPA、DHA美国阿拉斯加鱼油进行对比市售美国阿拉斯加鱼油60元一瓶(100粒每粒1g)。国产粗鱼油每kg 3-5元，无水乙醇每kg 5元(工业)，正己烷每kg 80元，硝酸银每10g，100元(试剂)。1000g国产粗鱼油可生产乙酯化鱼油1125g可得EPA，DHA总量90％的产品225g。由于正己烷，硝酸银基本可完全回收，乙醇可回收40％。故每生产100g EPA、DHA总量90％的产品，需成本约14.6-15.6元，而100g EPA、DHA总含量等于30％的阿拉斯加鱼油售价60元。如折算成30％EPA、DHA总含量计算，我们研制的鱼油100g，成本约在5元。通过对比，我们研制的高含量的EPA、DHA在市场上一定有很好的竞争力，创造出巨大的经济效益和社会效益。

　　我们还通过药理学实验证实，鱼油在适当的剂量下，不仅可以明显提高血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-G)的水平，同时还可以明显降低血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)以及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的水平，表明鱼油对实验性高脂血症大鼠具有明显的降血脂作用。结果还证实，高含量的鱼油与美国鱼油对实验性高脂血症大鼠的降脂作用基本相当。

　　药理学实验以下药理实验研究了从国产鱼油中分离出高含量DHA、EPA对实验性高脂血症大鼠血脂的影响，并与美国鱼油进行初步比较。

　　实验动物Wistar大鼠，体重18.2±6.0g(X±S)，雌雄各半，由天津市医学实验动物开发中心提供，合格证号医动字第006号。

　　实验药物本发明高含量鱼油由天津市医药科学研究所合成室提供(含量EPA 38.86％、DHA 54.42％)，其1g各成份含量与美国鱼油3g相当。

　　阿拉斯加深海鱼油，美国T、T保健食品公司出品(含量EPA+DHA30％)，美国原装，生产日期1998年6月16日。

　　以上鱼油配制方法称取适量鱼油放在乳钵中，加入一定量的吐温80研磨，然后加水配制成乳剂供试验用，给药体积均为每公斤体重10ml。

　　康利脂胶囊为浙江越州制药有限公司产品，批号990602，以蒸馏水配制成混悬液，供实验用。

　　高密度脂蛋白胆固醇试剂盒，北京中生生物工程高技术公司生产，批号990101。

　　低密度脂蛋白胆固醇试剂盒，北京中生生物工程高技术公司生产，批号990101。

　　实验方法选用体重18.2±6.0g(X±S)大鼠70只，均分七组，每组10只，雌雄各半，第一组为正常对照组，每日喂饲普通饲料，同时灌胃给予蒸馏水10ml/kg.d；第二组为高脂对照组，每日喂饲高脂饲料(蛋黄粉10％，猪油5％，胆盐0.5％，普通饲料85％)，同时灌胃给予蒸馏水100ml/kg.d；以下五组均喂饲高脂饲料，同时灌胃给予不同药物，第三组为高脂饲料+鱼油0.5g/kg.d；第四组为高脂饲料+鱼油1.0g/kg.d；第五组为高脂饲料+鱼油2.0g/kg.d；第六组为高脂饲料+美国鱼油3.0g/kg.d；第七组为高脂饲料+康利脂300mg/kg.d(其中鱼油1.0g/kg组与美国鱼油组EPA和DHA含量相当)。每日上午灌胃给药，连续5周，每周称重一次。末次给药后，所有动物禁食12小时，然后由股动脉放血，3000/min离心20分钟，分离血清。用酶法测定总胆固醇(TC)含量，甘油三酯(TG)含量，采用沉淀法测定高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量以及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量，然后进行组间比较。

　　2、本发明提供的高含量鱼油与美国鱼油对实验性高脂血症大鼠的降血脂作用基本相同。

　　1.一种从粗鱼油中提纯高含量DHA、EPA的方法，其特征在于先将粗鱼油乙酯化，再通过Ag+与不饱和双键形成络合物的特性使鱼油中含不饱和双键的DHA、EPA与Ag+反应生成络合物，并将DHA、EPA的混合物分离出来，然后通过Ag+(EPA)络合物、Ag+(DHA)络合物的稳定性不同，分离出高含量的DHA和EPA含量高于DHA的产品。

　　2.根据权利要求1所述的方法，其中按以下步骤完成粗鱼油的酯化将粗鱼油、无水乙醇、浓H2SO4加入反应体系，水浴回流进行反应，然后放入分液漏斗，静置过夜，分出酯化层，并回收乙醇。

　　3.根据权利要求2所述的方法，其中以1000克粗鱼油计算，加入无水乙醇800-2000ml，浓H2SO48-20克，反应时间为10小时，得到鱼油酯化产品900-1125克。

　　4.根据权利要求1所述的方法，其中按以下步骤完成Ag+(EPA)络合物、Ag+(DHA)络合物的制备将乙酯化鱼油产品、浓度为50-80％的AgNO3水溶液加入反应体系，室温反应3小时，放入分液漏斗，分离油层，得Ag+(EPA)络合物和Ag+(DHA)络合物产品，回收未反应的乙酯化鱼油。

　　6.根据权利要求5的所述的方法，其中以1000克乙酯化鱼油计算，加入500-1000克AgNO3水溶液。

　　7.根据权利要求1所述的方法，其中按以下步骤完成EPA、DHA混合物的制备室温条件下，往Ag+(EPA)络合物和Ag+(DHA)络合物中加入10-20倍体积的水，用正己烷萃取3次，有机层用无水硫酸钠干燥，回收溶剂得到DHA-EPA的混合物。

　　8.根据权利要求1所述的方法，其中按以下步骤完成高含量EPA的分离制备室温条件下，将Ag+(EPA)络合物和Ag+(DHA)络合物用2-5倍体积水溶解，用正己烷萃取3次，有机层用无水Na2SO4干燥，回收溶剂。

　　9.根据权利要求1所述的方法，其中按以下步骤完成高含量DHA产品的制备室温条件下，将Ag+(EPA)络合物和Ag+(DHA)络合物用水稀释2-5倍，分离有机层，水层用水稀释20倍，再用正己烷萃取3次。

　　10.根据权利要求1所述的方法，其中用正己烷或石油醚萃取提纯后的Ag+残留溶液，分离出有机物，水层在水浴上浓缩至液面起膜放凉得结晶，过滤，得AgNO3固体，回收的AgNO3固体可继续用于粗鱼油的分离提纯。

　　发明者陶遵威, 解红武, 周运琴, 刘惠芝 申请人:天津市医药科学研究所