反胶团内可溶解少量水而形反胶团内可溶解少量水而形成成微型水池微型水池蛋白质进入微蛋白质进入微水持中可随反胶团转入有水持中可随反胶团转入有机溶剂机溶剂但不与有机溶剂直但不与有机溶剂直接接触反胶团萃取就是利接接触反胶团萃取就是利用这一特性进行蛋白质分离用这一特性进行蛋白质分离的方法反胶团溶液是宏观的方法反胶团溶液是宏观上透明均一的热力学稳定体上透明均一的热力学稳定体反胶团萃取反胶团萃取成本低成本低选择性好萃取率和反萃取率高选择性好萃取率和反萃取率高操作方便放大容易操作方便放大容易萃取剂反胶团相可循环利用可循环利用蛋白质不易变性等优点蛋白质不易变性等优点影响因素多影响因素多反胶团萃取的特点反胶团萃取的特点3131表面活性剂表面活性剂反胶团reversedmicelle是表面活性剂分散于连续有机相中一种自发形成的纳米尺度的聚集体所以表面活性剂是反胶团溶液形成的关键

　　蛋白质溶入反胶束溶液主要受到表面活性剂 与蛋白质的静电作用 空间排阻作用的影响 静电作用、 的影响。 与蛋白质的静电作用、空间排阻作用的影响。

　　4.3 影响蛋白质分子向反胶团中转移的因素 4.3.1 静电作用力 a.对于阳/阴离子表面活性剂形成的反胶束体系 a.对于阳 阴离子表面活性剂形成的反胶束体系 对于 b.此外 离子型表面活性剂的反离子 此外， 反离子并不都固定 b.此外，离子型表面活性剂的反离子并不都固定 在反胶束表面，对于AOT反胶束，约有30 AOT反胶束 30％ 在反胶束表面，对于AOT反胶束，约有30％的反 离子处于解离状态。 离子处于解离状态。 c.同时 在反胶束“水池”内的离子和主体水相 同时， c.同时，在反胶束“水池”内的离子和主体水相 中的离子会进行交换，这样，在萃取时会同蛋白 中的离子会进行交换，这样， 质分子竞争表面活性剂离子， 质分子竞争表面活性剂离子，从而降低了蛋白质 和表面活性剂的静电作用力。 和表面活性剂的静电作用力。

　　-选择蛋白质萃取率最大时的表面活性剂浓度为最佳浓 选择蛋白质萃取率最大时的表面活性剂浓度为最佳浓 度

　　5.3表面活性剂类型及浓度的影响 表面活性剂类型及浓度的影响 a.类型 a.类型

　　-增强静电作用和增加反胶束大小的表面活性剂，除此 增强静电作用和增加反胶束大小的表面活性剂， 静电作用和增加反胶束大小的表面活性剂 以外，还应考虑形成反胶束及使反胶束变大( 以外，还应考虑形成反胶束及使反胶束变大(由于蛋白 质的进入)所需的能量的大小、 质的进入)所需的能量的大小、反胶束内表面的电荷密 度等因素，这些都会对萃取产生影响。 度等因素，这些都会对萃取产生影响。

　　若将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中， 若将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度 超过临界胶束浓度(CMC) 便会在有机溶剂内形成聚集体， (CMC)， 超过临界胶束浓度(CMC)，便会在有机溶剂内形成聚集体， 这种聚集体称为反胶团。 这种聚集体称为反胶团。 （3）结构特征 a.胶团 极性头向外，非极性尾向内，形成非极性核， 胶团： a.胶团：极性头向外，非极性尾向内，形成非极性核，溶 解非极性化合物. 解非极性化合物. b.反胶团 极性头向内，非极性尾向外，形成极性核，此 反胶团： b.反胶团：极性头向内，非极性尾向外，形成极性核 此 极性核具有溶解极性物质的能力。极性核溶解水后， 极性核具有溶解极性物质的能力。极性核溶解水后，就形 成了“水池” pool)， 成了“水池”(water pool)，当含有此种反胶束的有机 溶剂与蛋白质的水溶液接触后， 溶剂与蛋白质的水溶液接触后，蛋白质及其他亲水物质能 够通过螯合作用进入此“水池” 够通过螯合作用进入此“水池”。由于周围水层和极性基 团的保护，保持了蛋白质的天然构型，不会造成失活。 团的保护，保持了蛋白质的天然构型，不会造成失活。

　　度。临界胶束浓度是形成胶团或反胶团的表面活性剂的最 低浓度，用CMC表示。大小与表面活性剂的结构、溶剂、 温度和压力有关。

　　3.3 胶团、反胶团的形成 (1)胶团的形成： 将表面活性剂溶于水中， 将表面活性剂溶于水中，当其浓度超过临界胶 束浓度(CMC) (CMC)时 束浓度(CMC)时，表面活性剂就会在水溶液中 聚集在一起而形成聚集体，在通常情况下， 聚集在一起而形成聚集体，在通常情况下，这 种聚集体是水溶液中的胶束，称为胶团。 种聚集体是水溶液中的胶束，称为胶团。

　　基本概念 反胶团溶液形成的条件和特性 反胶团萃取蛋白质的基本原理 影响反胶团萃取蛋白质的主要因素

　　• 表面活性剂分子的两亲 表面活性剂分子的两亲 性质使之在水溶液中能 性质使之在水溶液中能 自发形成结构有序的多 自发形成结构有序的多 分子聚集体,通常称为胶 分子聚集体,通常称为胶 团。 • 胶团具有表面活性剂烷 烃链构成的疏水内核和 烃链构成的疏水内核和 亲水基团包裹着的外壳, 亲水基团包裹着的外壳, 即所谓的核 即所谓的核-壳结构

　　表面性质不同的蛋白质可能以不同的形式溶解于反 表面性质不同的蛋白质可能以不同的形式溶解于反 亲水性蛋白质， 胶团相，但对于亲水性蛋白质 胶团相，但对于亲水性蛋白质，目前普遍接受的是 水壳模型。例如：(1)反胶团内 反胶团内酶 水壳模型。例如：(1)反胶团内酶的结构和活性与 W0值密切相关 值密切相关， W0值密切相关，说明酶对其周围存在的水层非常敏 (2)反胶团内酶反应动力学行为与在正常的水 反胶团内酶反应动力学行为 感；(2)反胶团内酶反应动力学行为与在正常的水 相中相似，活性与pH的关系同样表现为钟状曲线。 相中相似，活性与pH的关系同样表现为钟状曲线。 pH的关系同样表现为钟状曲线

　　反胶团的大小与溶剂和表面 活性剂的种类与浓度、温度、 活性剂的种类与浓度、温度、 离子强度等因素有关， 离子强度等因素有关，一般 20nm。 为5－20nm。

　　关于反胶团溶解蛋白质的形式，有人提出了四种模型 四种模型， 关于反胶团溶解蛋白质的形式，有人提出了四种模型， 如图所示， 如图所示，其中 (a)为水壳模型 蛋白质位于水池的中心， 模型， (a)为水壳模型，蛋白质位于水池的中心，周围存在的 水层将其与反胶团壁(表面活性剂)隔开； 水层将其与反胶团壁(表面活性剂)隔开； (b)蛋白质分子表面存在强烈疏水区域， 蛋白质分子表面存在强烈疏水区域 (b)蛋白质分子表面存在强烈疏水区域，该疏水区域直 接与有机相接触； 接与有机相接触； (c)蛋白质吸附于反胶团内壁； 蛋白质吸附于反胶团内壁 (c)蛋白质吸附于反胶团内壁； (d)蛋白质的疏水区与几个反胶团的 蛋白质的疏水区与几个反胶团的表面活性剂疏水尾 (d)蛋白质的疏水区与几个反胶团的表面活性剂疏水尾 发生相互作用，被几个小反胶团所“溶解” 发生相互作用，被几个小反胶团所“溶解”。

　　有机相中一种自发形成的纳米尺度的聚集体，所以表面活 性剂是反胶团溶液形成的关键。 表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极 性基团两部分组成的两性分子，可分为阴离子表面活性 剂、阳离子表面活性剂和非离子型表面活性剂。

　　在反胶束萃取蛋白质的研究中，用得最多的是阴离子表 面活性剂AOT(AerosolOT)，其化学名为丁二酸－2－乙基 己基磺酸钠

　　该表面活性剂容易获得， 特点是具有双链， 该表面活性剂容易获得，其特点是具有双链，极性基 是具有双链 团较小、形成反胶束时不需加助表面活性剂， 团较小、形成反胶束时不需加助表面活性剂，并且所 形成的反胶束较大，半径为170nm，有利于大分子蛋 形成的反胶束较大，半径为 ， 白质进入。 白质进入。

　　何谓胶团、 何谓胶团、反胶团 • 反胶团是指当油相中 表面活性剂的浓度超 过临界胶束浓度后,其 分子在非极性溶剂中 自发形成的亲水基向 内、疏水基向外的具 有极性内核(polarcore) 的多分子聚集体

　　• 反胶团是表面活性剂分子溶 于非极性溶剂中自发形成的 其中表面活性剂的 聚集体 ,其中表面活性剂的 极性头朝内而非极性头朝外 与有机溶剂接触。 与有机溶剂接触。 • 反胶团内可溶解少量水而形 微型水池， 成微型水池，蛋白质进入微 水持中， 水持中，可随反胶团转入有 机溶剂， 机溶剂，但不与有机溶剂直 接接触， 接接触，反胶团萃取就是利 用这一特性进行蛋白质分离 的方法， 的方法，反胶团溶液是宏观 上透明均一的热力学稳定体 系。

　　成本低 选择性好、萃取率和反萃取率高 操作方便、放大容易 萃取剂 (反胶团相 )可循环利用 蛋白质不易变性等优点 影响因素多

　　3.反胶团溶液形成的条件和特性 3.反胶团溶液形成的条件和特性 3.1表面活性剂 3.1表面活性剂

　　常使用的阳离子表面活性剂名称和结构如下： 常使用的阳离子表面活性剂名称和结构如下： (1)CTAB(溴化十六烷基三甲胺/十六烷基三甲基胺溴) －需要助表面活性剂

　　常使用的阳离子表面活性剂名称和结构如下： 常使用的阳离子表面活性剂名称和结构如下： (3) TOMAC(氯化三辛基甲铵 氯化三辛基甲铵) 氯化三辛基甲铵

　　解释：对于包含大蛋白分子的反胶束， 解释：对于包含大蛋白分子的反胶束，其尺寸远大于 消耗较多的能量， 空核”的反胶束，萃取时势必要消耗较多的能量 “空核”的反胶束，萃取时势必要消耗较多的能量，这 些能量只能通过较强的静电相互作用得到补偿。 较强的静电相互作用得到补偿 些能量只能通过较强的静电相互作用得到补偿。用调节 pH来增加蛋白质分子表面电荷的方法 来增加蛋白质分子表面电荷的方法， pH来增加蛋白质分子表面电荷的方法，是增强静电作用 的一条途径。 的一条途径。 对那些尺寸小于“空核”的反胶束中水体积的蛋白质 中水体积的蛋白质， 对那些尺寸小于“空核”的反胶束中水体积的蛋白质， 只要其所携带的净电荷与表面活性剂电性相反， 只要其所携带的净电荷与表面活性剂电性相反，萃取就 能发生。蛋白质的相对分子质量Mr (pH-pI)绝对值呈 Mr与 能发生。蛋白质的相对分子质量Mr与(pH-pI)绝对值呈 线性关系,见上图。 线影响反胶团萃取的主要因素

　　蛋白质的萃取， 蛋白质的萃取，与蛋白质的表面电荷和反胶束内表面 电荷间的静电作用 以及反胶束的大小有关 静电作用， 有关。 电荷间的静电作用，以及反胶束的大小有关。

　　（1）对相对分子质量相近的蛋白质： 相对分子质量相近的蛋白质： 蛋白质的电荷及稳定性 不同相对分子质量的蛋白质，pH值对萃取率的 （2）对不同相对分子质量的蛋白质，pH值对萃取率的 影响有差异性，当蛋白质相对分子质量增加时， 影响有差异性，当蛋白质相对分子质量增加时，只有 增大(pH PI)值的绝对值 相转移才能顺利完成。 (pH值的绝对值， 增大(pH-PI)值的绝对值，相转移才能顺利完成。 如：α-糜蛋白酶(Wr25000)的萃取率在pH低于pI2-4 糜蛋白酶(Wr25000)的萃取率在pH低于pI2(Wr25000)的萃取率在pH低于pI2 时达到最高，而牛血清蛋白(Wr68000) 时达到最高，而牛血清蛋白(Wr68000)在相同的系统中 根本不发生相转移

　　离子强度对萃取率 的影响以下几个方 面： ①影响蛋白质与表 面活性剂极性基团 的静电作用； 的静电作用； ②影响反胶团的大 小； 离子进入“ ③离子进入“微水 池”影响其他溶质 的进入。 的进入。

　　如离子强度(KCl 浓度) 如离子强度(KCl 浓度) 对萃取核糖酸酶a, a,细胞 对萃取核糖酸酶a,细胞 色素c 色素c和溶菌酶的影响 见图

　　4.3.2 位阻效应 许多亲水性物质，如蛋白质、 许多亲水性物质，如蛋白质、核酸及氨基酸 生物大分子的分子较大 的分子较大， 等生物大分子的分子较大，当反胶团直径较小 会对蛋白质产生空间排阻作用， 时，会对蛋白质产生空间排阻作用，从而使蛋 白质在反胶团中的溶解度降低， 白质在反胶团中的溶解度降低，这种现象称为 位阻效应。 位阻效应。 反胶团的“水池”直径受含水率W 的调节， 反胶团的“水池”直径受含水率W0的调节， 当水溶液中盐浓度较高时， 当水溶液中盐浓度较高时，无机盐对反胶团产 生脱水作用， 下降，反胶团尺度减小， 生脱水作用，使W0下降，反胶团尺度减小，位 阻效应加强，蛋白质的萃取率明显降低。 阻效应加强，蛋白质的萃取率明显降低。