待转质粒10l，与AV-1感受态细胞混合，加入到电转杯(2mm)，场强2KV(1KV/mm)，

　　将连接液转化Top10大肠杆菌感受态细胞，涂LB(A-I-X)的LB琼脂平板，置37℃恒温箱，培养14-18h。

　　从LB(A-I-X)平板上挑取几个白色单菌落并做好对应标记，分别接入含800l低盐培养液的无菌EP管中，250rpm培养3h左右。每个菌取200l在沸水中煮5min，12000rmp室温离心2min。上清作为PCR的模板DNA,PCR体系见表3.13

　　PCR产物进行0.7%琼脂糖凝胶电泳，阳性菌接种到5ml的低盐培养液中，加Amp至终浓度100ug/ml，200rpm,37℃过夜培养。

　　使用质粒抽提试剂盒（上海天根生化科技公司（Tiangen）），抽提得50l质粒，于-20℃保存备用。

　　将上述酶切后的DNA样品在0.7 %琼脂糖凝胶上电泳，割下含目的片段的琼脂糖块，用Gel Extraction Mini Kit进行回收纯化，得到双酶切片段各30l。

　　2.①LB液体培养基:按酵母粉5 g/l，胰蛋白胨10 g/l，NaCl5 g/l称取各组分，加入去离子水后用10 mol/l NaOH调pH至7.0，并用去离子水定容。混匀后121℃高压蒸气灭菌25 min。

　　②LB氨苄固体培养基:按2g/100ml向LB液体培养基中加入琼脂粉，121℃高压灭菌25 min。趁热摇匀，冷却至约60℃，加入Amp至终浓度100g/ml，摇匀后倒入培养皿中。凝固后于37℃恒温箱中烘干，保存在4℃冰箱中。

　　③染色液：称取2.5 g考马斯亮蓝R-250，加入450 ml甲醇，100 ml乙酸，定容至1000 ml，用滤纸过滤后可使用。

　　⑧各管细胞沉淀用2 ml冰冷CaCl2重悬，按100l/管分装于预冷的无菌EP管中

　　①0.7 %琼脂糖凝胶：称取0.28 g琼脂糖溶于40 ml 1TAE缓冲液中，在微波炉中加热，待琼脂糖完全溶解后迅速倒入制胶台。冷却40分钟后可点样电泳。

　　从LB(Amp)平板上挑取几个单菌落并做好对应标记，进行菌落PCP鉴定，用M13引物同③。根据电泳结果从转化板上挑取对应的阳性克隆得转化子